PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Silva V.A.S., Kim P.C.P., Barros M.R., Vilela S.M.O., Silva L.B.G. & Mota R.A. 2014. [Avibacterium paragallinarum identification in broiler and commercial laying hens in the state of Pernambuco, Brazil.] Identificação de Avibacterium paragallinarum em frangos de corte e poedeiras comerciais no Estado de Pernambuco. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(9):819-821. Labora­tório de Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Ru­ral de Pernambuco, Avenida Dom Manoel de Medeiros s/n, Bairro Dois Irmãos, Recife, PE 52171-900, Brazil. E-mail: rinaldo.mota@hotmail.com Pullets of the Brazilian poultry industry are susceptible to outbreaks of infectious diseases with economic losses, mainly caused by Mycoplasma, Avibacterium paragallinarum and viruses affecting the respiratory tract. The objective of this study was to verify the involvement of A. paragallinarum in an outbreak of avian respiratory disease. Eighteen swabs from the infra-orbital sinuses were collected, six samples from broilers and twelve from hens with clinical signs. The samples were cultured in specific media for the agent and also tested with the molecular technique of Polymerase Chain Reaction (PCR). All samples cultured in specific media were negative; PCR revealed two samples (16.66%) as positive. The detection of A. paragallinarum by PCR in laying hens with clinical respiratory signs indicates that this bacterium is associated with the etiology of respiratory syndrome in poultry farms in the state of Pernambuco.

• Avibacterium paragallinarum infectious coryza PCR coriza infecciosa

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Silva V.A.S., Kim P.C.P., Barros M.R., Vilela S.M.O., Silva L.B.G. & Mota R.A. 2014. [Avibacterium paragallinarum identification in broiler and commercial laying hens in the state of Pernambuco, Brazil.] Identificação de Avibacterium paragallinarum em frangos de corte e poedeiras comerciais no Estado de Pernambuco. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(9):819-821. Labora­tório de Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Ru­ral de Pernambuco, Avenida Dom Manoel de Medeiros s/n, Bairro Dois Irmãos, Recife, PE 52171-900, Brazil. E-mail: rinaldo.mota@hotmail.com As aves da indústria avícola brasileira são suscetíveis a surtos de doenças infecciosas relacionadas a perdas econômicas, principalmente por enfermidades infecciosas causadas por Mycoplasma, Avibacterium paragallinarum e vírus que acometem o trato respiratório. Objetivou-se neste estudo pesquisar o envolvimento de A. paragallinarum em surto de doença respiratória aviária. Foram coletados 18 swabs da região infraorbitária dos seios nasais de aves, sendo seis amostras de frangos de corte com sinais clínicos e 12 de poedeiras com sinais clínicos. As amostras foram cultivadas em meios específicos para o agente e também testadas com a técnica molecular Reação em Cadeia de Polimerase. Das amostras analisadas no isolamento, 100% foram negativas. Na PCR, duas (16,66%) foram positivas. A detecção de A. paragallinarum na PCR em galinhas poedeiras com sinais clínicos respiratótios indica que esta bactéria está associada à etiologia da síndrome respiratória das aves nas granjas no estado de Pernambuco.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Caitano M.A.B., Soares C.O., Ramos C.A.N., Ferraz A.L.J., Sanches C.C. & Rosinha G.M.S. 2014. [Detection of Brucella abortus in bovine tissue using PCR and qPCR.] Detecção de Brucella abortus em tecidos bovinos utilizando ensaios de PCR e qPCR. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(6):497-502. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Av. Felinto Müller 2443, Ipiranga, Campo Grande, MS 79070-900, Brazil. E-mail: gracia.rosinha@embrapa.br The aim of the study was to evaluate the technical polymerase chain reaction (PCR) and Real-Time PCR (qPCR) to detect Brucella abortus from bovine tissues with suggestive lesions of brucellosis. For this, 21 fragments of bovine tissues collected at abattoirs of Mato Grosso do Sul were processed and subjected to microbiological culture and extraction of genomic DNA to perform the PCR reactions and qPCR. Eight samples of microbiological culture showed bacterial growth and five samples were confirmed as B. abortus by PCR. DNA of Brucella (IS711 primers) was detected in 13 (61.9%) directly from tissue samples and 17 (81%) from tissue homogenate samples. With the species-specific set of primers BruAb2_0168F and BruAb2_0168R, 14 (66%) tissue samples and 18 (85.7%) tissue homogenate samples were positive. Six positive samples in the species-specific PCR were sequenced and the best hit in the BLASTn analysis was B. abortus. By qPCR, 21 (100%) tissue samples and 19 (90.5%) tissue homogenate samples were positive for B. abortus. Ten samples of DNA from bovine blood from an accredited-free herd were used as negative control in PCR and qPCR analysis using the primers BruAb2_0168F and BruAb2_0168R, and no one amplified by PCR, whereas two samples were amplified by qPCR (20%). In conclusion, both techniques detect the presence of B. abortus directly from tissues and homogenized, but the qPCR showed high sensitivity. The results indicate that qPCR can represent an alternative tool for faster and more accurate detection of B. abortus directly from tissues, and use in health surveillance programs by presenting satisfactory sensitivity and specificity.

• Brucellosis Brucella abortus brucelose

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Caitano M.A.B., Soares C.O., Ramos C.A.N., Ferraz A.L.J., Sanches C.C. & Rosinha G.M.S. 2014. [Detection of Brucella abortus in bovine tissue using PCR and qPCR.] Detecção de Brucella abortus em tecidos bovinos utilizando ensaios de PCR e qPCR. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(6):497-502. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Av. Felinto Müller 2443, Ipiranga, Campo Grande, MS 79070-900, Brazil. E-mail: gracia.rosinha@embrapa.br Objetivou-se no presente estudo avaliar as técnicas reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em Tempo Real (qPCR) para detectar Brucella abortus, a partir de tecidos bovinos com lesões sugestivas de brucelose. Para isto, 21 fragmentos de tecidos bovinos coletados em abatedouros de Mato Grosso do Sul foram processados e submetidos ao cultivo microbiológico e extração do DNA genômico para realização das reações de PCR e qPCR. No cultivo microbiológico, oito amostras apresentaram crescimento bacteriano e cinco foram confirmadas como B. abortus por PCR. Diretamente das amostras de tecido, DNA do gênero Brucella (oligonucleotídeos IS711) foi detectado em 13 (61,9%) amostras de tecido e 17 (81%) amostras de homogeneizado. Já com os oligonucleotídeos espécie-específicos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R, 14 (66%) amostras de tecido e 18 (85,7%) amostras de homogeneizado foram amplificadas. Seis amostras positivas na PCR espécie-específica foram sequenciadas e o best hit na análise BLASTn foi B. abortus. Na qPCR, 21 (100%) amostras de tecidos e 19 (90,5%) amostras de homogeneizado foram positivas para B. abortus. Dez amostras de DNA de sangue bovino de rebanho certificado livre foram utilizadas como controle negativo nas análises de PCR e qPCR utilizando-se os oligonucleotídeos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R. Na PCR nenhuma amostra amplificou, enquanto que na qPCR 2 (20%) amplificaram. Conclui-se que as duas técnicas detectam a presença de B. abortus diretamente de tecidos e homogeneizados, porém a qPCR apresentou maior sensibilidade. Os resultados obtidos indicam que a qPCR pode representar uma alternativa rápida e precisa para a detecção de B. abortus diretamente de tecidos, e ser utilizada em programas de vigilância sanitária, por apresentar sensibilidade e especificidade satisfatórias.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Bacanelli G.M., Ramos C.A.N. & Araújo F.R. 2014. Molecular diagnosis of Anaplasma marginale in cattle: quantitative evaluation of a real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) based on msp5 gene. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(1):29-33. Embrapa Gado de Corte, Avenida Rádio Maia 830, Campo Grande, MS 79106-550, Brazil. E-mail: flabio.araujo@embrapa.br The rickettsia Anaplasma marginale is considered the main agent of bovine anaplasmosis. Due the nonspecific clinical signs of the anaplasmosis, the diagnosis of infection depends of laboratory confirmation. In recent years, molecular diagnostic methods have been used to detect A. marginale in cattle. However, the existence of a large number of assays of different sensitivity and cost makes the choice of an appropriate test difficult. In the present study, a real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the msp5 target gene was quantitatively assessed and compared to an end point PCR. Both reactions were subjected to sensitivity and specificity evaluation using plasmid DNA and samples from cattle experimentally infected with A. marginale. A comparative field trial of the tests was carried out using samples of cattle from a stable enzootic area for A. marginale. The real-time PCR showed a higher sensitivity than the end point PCR. This reaction (i.e. real-time PCR) was able to detect one copy of the msp5 gene in 100 ηg of plasmidial DNA, and more than 80% of its results were positive among experimentally infected animals seven days after infection. In addition, based on in silico analysis, the real-time PCR evaluated in the present study appears to be useful for the detection of A. ovis.

• Anaplasma marginale msp5 gene gene msp5

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Bacanelli G.M., Ramos C.A.N. & Araújo F.R. 2014. Molecular diagnosis of Anaplasma marginale in cattle: quantitative evaluation of a real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) based on msp5 gene. [Diagnóstico molecular de Anaplasma marginale em bovinos: avaliação quantitativa de uma PCR em tempo real baseada no gene msp5.] Pesquisa Veterinária Brasileira 34(1):29-33. Embrapa Gado de Corte, Avenida Rádio Maia 830, Campo Grande, MS 79106-550, Brazil. E-mail: flabio.araujo@embrapa.br A riquétsia Anaplasma marginale é considerada o principal agente da anaplasmose bovina. Devido a não especificidade dos sinais clínicos, a confirmação da infecção nos animais depende de testes laboratoriais. Recentemente, métodos de diagnóstico molecular têm sido aplicados para detecção de A. marginale em bovinos. No entanto, a grande quantidade de testes com diferentes sensibilidade e custos tem dificultado a escolha do ensaio mais adequado. No presente estudo, uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 foi avaliada quantitativamente e comparada a uma reação de PCR convencional. As reações foram submetidas à avaliação de sensibilidade e especificidade com DNA plasmidial e amostras provenientes de bovinos experimentalmente infectados por A. marginale. Uma avaliação comparativa a campo foi realizada entre os testes utilizando amostras provenientes de bovinos criados em uma região de estabilidade enzoótica para A. marginale. Embora os testes não tenham apresentado diferença estatisticamente significativa, a PCR em tempo real apresentou valor de sensibilidade maior do que a PCR convencional. A PCR em tempo real foi capaz de detectar uma cópia de msp5 em 100ng de DNA plasmidial, e mais de 80% de resultados positivos entre bovinos experimentalmente infectados apenas sete dias após infecção. Além disso, baseado em análise in silico, a PCR em tempo real avaliada aqui pode ser útil para detecção de Anaplasma ovis.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Moura C., Tiba M.R., Silva M.J. & Leite D.S. 2013. Identification of new flagellin-encoding fliC genes in Escherichia coli isolated from domestic animals using RFLP-PCR and sequencing methods. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(4):417-422. Universidade Paulista, Av. Armando Giassetti 577, Vila Hortolândia, Trevo Itu/Itatiba, Jundiaí, SP 13214-525, Brazil. E-mail: cmoura.bio@gmail.com Identification of Escherichia coli requires knowledge regarding the prevalent serotypes and virulence factors profiles allows the classification in pathogenic/non-pathogenic. However, some of these bacteria do not express flagellar antigen in vitro. In this case the PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) and sequencing of the fliC may be suitable for the identification of antigens by replacing the traditional serology. We studied 17 samples of E. coli isolated from animals and presenting antigen H nontypeable (HNT). The H antigens were characterized by PCR-RFLP and sequencing of fliC gene. Three new flagellin genes were identified, for which specific antisera were obtained. The PCR-RFLP was shown to be faster than the serotyping H antigen in E. coli, provided information on some characteristics of these antigens and indicated the presence of new genes fliC.

• Escherichia coli H antigen antígeno H

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Moura C., Tiba M.R., Silva M.J. & Leite D.S. 2013. Identification of new flagellin-encoding fliC genes in Escherichia coli isolated from domestic animals using RFLP-PCR and sequencing methods. [Identificação de novas flagelinas codificadas por fliC em Escherichia coli isoladas de animais domésticos utilizando RFLP-PCR e sequenciamento.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(4):417-422. Universidade Paulista, Av. Armando Giassetti 577, Vila Hortolândia, Trevo Itu/Itatiba, Jundiaí, SP 13214-525, Brazil. E-mail: cmoura.bio@gmail.com A identificação da Escherichia coli requer conhecimento sobre os sorotipos e fatores de virulência prevalentes permitindo a classificação em patogênico/não patogênico. No entanto, algumas destas bactérias não expressam o antígeno flagelar in vitro. Neste caso, o PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) e o sequenciamento do gene fliC podem ser adequados para a identificação desses antígenos, substituindo a sorologia tradicional. Nesta pesquisa foram estudadas 17 amostras de E. coli isoladas de animais e que apresentavam antígeno H não tipável (HNT). Os antígenos H foram caracterizados por PCR-RFLP e sequenciamento do gene fliC. Três novos genes da flagelina foram identificados, para os quais anti-soros específicos foram obtidos. A técnica PCR-RFLP mostrou-se mais rápida que a sorotipagem do antígeno H em E. coli, fornecendo informações sobre algumas características desses antígenos e indicou a presença de novos genes fliC.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Furian T.Q., Borges K.A., Rocha S.L.S., Rodrigues E.E., Nascimento V.P., Salle C.T.P. & Moraes H.L.S. 2013. Detection of virulence-associated genes of Pasteurella multocida isolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(2):177-182. Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 8824, Porto Alegre, RS 91540-000, Brazil. E-mail: thales.furian@ufrgs.br The current systems of breeding poultry, based on high population density, increase the risk of spreading pathogens, especially those causing respiratory diseases and those that have more than one host. Fowl Cholera (FC) is one such pathogen, and even though it represents one of several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that present with sudden death, the pathogenesis and virulence factors involved in FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate twelve genes related to virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. The protocols developed were capable of detecting all of the proposed genes. The ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB and nanB genes were present in 100% of the samples (25/25), the sodA and nanH genes were present in 96% (24/25), ptfA was present in 92% (23/25), and pfhA was present in 60% (15/25). Gene toxA was not identified in any of the samples studied (0/25). Five different genetic profiles were obtained, of which P1 (negative to toxA) was the most common. We concluded that the multiplex-PCR protocols could be useful tools for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and the fact that all samples belonged to the same subspecies of P. multocida, five genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

• Pasteurella multocida fowl cholera avian pasteurellosis pasteurelose aviária

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Furian T.Q., Borges K.A., Rocha S.L.S., Rodrigues E.E., Nascimento V.P., Salle C.T.P. & Moraes H.L.S. 2013. Detection of virulence-associated genes of Pasteurella multocida isolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR. [Pesquisa de genes associados à virulência em cepas de Pasteurella multocida isoladas em casos de cólera aviária através da técnica de multiplex-PCR.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(2):177-182. Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 8824, Porto Alegre, RS 91540-000, Brazil. E-mail: thales.furian@ufrgs.br Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de patógenos, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuam mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) apresenta estas características e apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar doze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). O gene toxA não foi identificado em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). Foram obtidos cinco diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para o gene toxA) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados cinco perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras.

Abstract in English:

The aim of this study was used diagnostic methods (histopathological, bacteriological and molecular) in the trial of suspected tuberculosis lesions observed during routine post mortem inspection in abattoirs. A total of of 41,193 cattle, which appeared healthy in ante mortem examination, slaughtered in seven abattoirs in the state of Mato Grosso, Brazil were examined. The carcasses of 198 (0.48%) animals showed lesions, of which 182 (91.9%) were classified as granulomatous or pyogranulomatous by histopathological analysis. However, at bacilloscopy, the presence of acid-fast bacilli (AFB) was not detected. Mycobacterium bovis was recovered from 3 (1.5%) samples, all from retropharyngeal lymph nodes in cattle up to three years old. When multiplex PCR (m-PCR) was performed directly on fragments of injured tissue, M. bovis DNA was detected in 14 (7.0%) samples including the same 3 bacteriologically positive samples. Evaluation of lesions by macroscopic analysis agreed 93% (184/198) with bacteriological culturing and the molecular test. To avoid misinterpretation during the examination, mainly of paucibacillary lesions such as those found in the samples analyzed, the use of rapid and unequivocal complementary tests such as mPCR is recommended. Molecular diagnosis, combined with routine post mortem inspection, proved to be a promising technique to improve the surveillance of TB in abattoirs, contributing to the success of the bovine tuberculosis eradication program.

• Mycobacterium bovis tuberculosis macroscopic analysis bacteriology histopathology multiplex PCR

Abstract in Portuguese:

O objetivo foi utilizar métodos complementares de diagnóstico (histopatológicos, bacteriológicos e moleculares), no julgamento de lesões suspeitas de tuberculose observadas durante a inspeção post mortem de rotina em abatedouros. Foi acompanhado o abate e a inspeção de 41.193 bovinos, sadios ao exame ante mortem, em sete abatedouros no estado de Mato Grosso. Carcaças de 198 (0,48%) animais apresentaram lesões, sendo 182 (92,0%) classificadas como granulomatosas ou piogranulomatosas na avaliação histopatológica. Entretanto, na baciloscopia, não foi evidenciada a presença de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Mycobacterium bovis foi isolado em três (1,5%) lesões, provenientes de linfonodos retrofaringeanos de bovinos com até três anos de idade. Quando usado a PCR múltipla (m-PCR) diretamente nos fragmentos de tecido, detectou-se a presença de DNA de M. bovis em 14 (7,0%) lesões, incluindo as três amostras identificadas na análise bacteriológica. O julgamento das lesões pelo exame macroscópico concordou em 93,0% (184/198) com os resultados obtidos por meio da PCR. A fim de evitar equívocos durante a avaliação, principalmente das lesões paucibacilares, como as encontradas neste estudo, recomenda-se a utilização de testes complementares rápidos e confirmatórios. A m-PCR, associada à inspeção post mortem de rotina, demonstrou ser uma técnica promissora para a vigilância da tuberculose bovina em abatedouros, contribuindo para o sucesso do programa de erradicação da tuberculose bovina.

• Mycobacterium bovis tuberculose histopatologia bacteriologia multiplex PCR

Abstract in English:

ABSTRACT.- Almeida P.R., Andrade C.P., Almeida L.L., Oliveira L.G.S., Castro L.A., Zlotowski P., Silva S.C. & Driemeier D. 2012. Nested-PCR for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchial alveolar swabs, frozen tissues and formalin-fixed paraffin-embedded swine lung samples: Comparative evaluation with immunohistochemical findings and histological features. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(8):715-720. Setor de Patologia Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brazil. E-mail: davetpat@ufrgs.br. The diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae infection is often performed through histopathology, immunohistochemistry (IHC) and polymerase chain reaction (PCR) or a combination of these techniques. PCR can be performed on samples using several conservation methods, including swabs, frozen tissue or formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue. However, the formalin fixation process often inhibits DNA amplification. To evaluate whether M. hyopneumoniae DNA could be recovered from FFPE tissues, 15 lungs with cranioventral consolidation lesions were collected in a slaughterhouse from swine bred in herds with respiratory disease. Bronchial swabs and fresh lung tissue were collected, and a fragment of the corresponding lung section was placed in neutral buffered formalin for 48 hours. A PCR assay was performed to compare FFPE tissue samples with samples that were only refrigerated (bronchial swabs) or frozen (tissue pieces). M. hyopneumoniae was detected by PCR in all 15 samples of the swab and frozen tissue, while it was detected in only 11 of the 15 FFPE samples. Histological features of M. hyopneumoniae infection were presented in 11 cases and 7 of these samples stained positive in IHC. Concordance between the histological features and detection results was observed in 13 of the FFPE tissue samples. PCR was the most sensitive technique. Comparison of different sample conservation methods indicated that it is possible to detect M. hyopneumoniae from FFPE tissue. It is important to conduct further research using archived material because the efficiency of PCR could be compromised under these conditions.

• Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Almeida P.R., Andrade C.P., Almeida L.L., Oliveira L.G.S., Castro L.A., Zlotowski P., Silva S.C. & Driemeier D. 2012. Nested-PCR for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchial alveolar swabs, frozen tissues and formalin-fixed paraffin-embedded swine lung samples: Comparative evaluation with immunohistochemical findings and histological features. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(8):715-720. Setor de Patologia Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brazil. E-mail: davetpat@ufrgs.br. O diagnóstico de infecção por Mycoplasma hyopneumoniae é frequentemente realizado através de histopatologia, imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR), ou uma combinação dessas técnicas. PCR pode ser realizada a partir de amostras submetidas a vários métodos de conservação, incluindo swabs, tecido refrigerado ou congelado, ou ainda tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFEP). Entretanto, o processo de fixação em formalina pode inibir a amplificação de DNA. Para avaliar se DNA de M. hyopneumoniae poderia ser recuperado de tecido FFEP, 15 pulmões com lesões de consolidação crânio-ventral de suínos oriundos de rebanhos com problemas respiratórios foram selecionados no abatedouro. Swabs bronquiais e pulmão fresco foram colhidos, e um fragmento da mesma porção de pulmão foi colocado por 48 horas em solução de formalina tamponada e posteriormente processado e embebido em parafina. PCR foi realizada comparando amostras de tecido fixado em formalina com amostras que passaram somente por refrigeração (swab bronquial) ou foram congeladas (fragmentos de tecido). A detecção de M. hyopneumoniae ocorreu em todas as 15 amostras de swabs e tecido congelado enquanto em amostras de tecido FFEP, o agente foi detectado somente em 11 das 15 amostras. Características histológicas de infecção por M. hyopneumoniae ocorreram em 11 casos e 7 destas amostras obtiveram marcação imuno-histoquímica positiva. Concordância entre histologia e detecção a partir de tecido FFEP foi observada em 13 casos. Dentre as técnicas analisadas, a PCR foi a mais sensível. A comparação de diferentes métodos de conservação de amostras indica que é possível detectar M. hyopneumoniae a partir de tecido FFEP, fato importante para pesquisa utilizando material arquivado, porém a eficácia do teste de PCR pode ficar comprometida sob essas condições.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Costa R.F.R., Santos I.F., Santana A.P., Tortelly R., Nascimento E.R., Fukuda R.T., Carvalho E.C.Q. & Menezes R.C. 2012. [Characterization of Cysticercus bovis lesions at postmortem inspection of cattle by gross examination, histopathology and polymerase chain reaction (PCR).] Caracterização das lesões por Cysticercus bovis, na inspeção post mortem de bovinos, pelos exames macroscópico, histopatológico e pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Pesquisa Veterinária Brasileira 32(6):477-484. Departamento de Saúde Coletiva Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua Vital Brazil Filho 64, Santa Rosa, Niterói, RJ 24230-340, Brazil. E-mail: rrfalcosta@yahoo.com.br Considering the importance of improving methods for diagnosis of bovine Cysticercosis, this study aimed to verify Cysticercus bovis occurrence in different anatomical sites, as head, heart, esophagus, diaphragm, tongue, liver and carcass, examined by federal inspection service. Diagnosis was performed by gross examination, histopatholgy and PCR with boiling DNA extraction for metacestode identification. Of 22043 slaughtered cattle, 713 (3.23%) were infected. The heart was mostly affected with 1.90% (420/22043), followed by head, 1.11% (245/22043), esophagus, 0.08% (18/22043), carcass, 0.07% (15/22043), diaphragm, 0.03% (7/22043), liver, 0.02% (5/22043) and tongue, 0.01% (3/22043). Of the cysts obtained, 58.35% (416/713) were dead and 41.65% (297/713) were alive. The differences among anatomical sites and cysts status were significant (p<0.05). Of the 416 dead cysts 253, characterized by nodular firm whitish lesions, containing yellowish material, some times in calcareous aspect were examined for histopathology. The histological exams of these cysts yielded granulomatous lesions, whose centers were characterized by caseous and/or calcareous material, multinucleate giant cells, histiocytes in palisade and infiltrate composed predominantly by lymphoid cells, wrapped up by fibrosis. Some times the lesions peripheries had granulation tissue and mineralized areas, like linear blade. The parasite debris were like a hyaline, non cellular material with spherical and ovoid, basophilic, eosinophilic and colorless corpuscles. These corpuscles were seen rarely, some times, among inflammatory reaction. Fibrous nodules, rich in lymphoid or mixed infiltrates, were frequently seen. Of the live cysts subjected to PCR with boiling DNA extraction, 65% (13/20) were positive for C. bovis, confirming the ambulatory diagnosis and the efficacy of the PCR procedure used. Due to microscopic and PCR diagnostic exams of C. bovis, mainly in the liver and esophagus, it is suggested changes in the 176 article of the regulatory inspection, by including these sites in the bovine routine inspection at the slaughterhouses.

• Cysticercus bovis Taenia saginata cysticercosis cisticercose

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Costa R.F.R., Santos I.F., Santana A.P., Tortelly R., Nascimento E.R., Fukuda R.T., Carvalho E.C.Q. & Menezes R.C. 2012. [Characterization of Cysticercus bovis lesions at postmortem inspection of cattle by gross examination, histopathology and polymerase chain reaction (PCR).] Caracterização das lesões por Cysticercus bovis, na inspeção post mortem de bovinos, pelos exames macroscópico, histopatológico e pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Pesquisa Veterinária Brasileira 32(6):477-484. Departamento de Saúde Coletiva Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua Vital Brazil Filho 64, Santa Rosa, Niterói, RJ 24230-340, Brazil. E-mail: rrfalcosta@yahoo.com.br Considerando a necessidade do conhecimento da cisticercose bovina e do aperfeiçoamento dos métodos de diagnóstico desta doença, objetivou-se verificar a ocorrência do Cysticercus bovis nos diversos locais anatômicos, tais como: cabeça, coração, esôfago, diafragma, língua, fígado e carcaça, examinados pelo Serviço de Inspeção Federal. O diagnóstico foi feito por macroscopia, microscopia e PCR com extração de DNA por fervura para a identificação do metacestóide. Dos 22043 bovinos abatidos, 713 (3,23%) estavam infectados. O coração foi o sítio anatômico mais afetado, com 1,90% (420/22043), seguido da cabeça, 1,11% (245/22043), do esôfago, 0,08% (18/22043), da carcaça, 0,07% (15/22043), do diafragma, 0,03% (7/22043), do fígado, 0,02% (5/22043) e da língua, 0,01% (3/22043). Dos cistos obtidos, 58,35% (416/713) estavam mortos e 41,65% (297/713), vivos. As diferenças entre os sítios anatômicos e a condição morfológica dos cistos foram significativas (p < 0,05). Dos 416 cistos mortos, 253 foram examinados por apresentarem características de: lesões nodulares firmes, brancacentas, com material amarelado, por vezes com aspecto calcário, no interior. O exame microscópico revelou granulomas comumente representados por centro necrótico e/ou mineralizado, envolto por histiócitos dispostos em paliçada, células gigantes multinucleadas, infiltrado misto, predominantemente de mononucleares, e fibrose. Por vezes, a periferia das lesões tinha características de tecido de granulação e mineralização em forma de lâminas lineares. Os restos parasitários foram identificados como um material hialino acelular, contendo elementos ovais e circulares, basofílicos, acidófilos e incolores, denominados corpúsculos calcários. Em algumas lesões foram observados raros corpúsculos, dispersos na reação inflamatória. Nódulos fibrosos, ricos em infiltrado linfóide ou crônico ativos, foram frequentemente visualizados. Dos cistos vivos examinados, 65% (13/20) foram positivos para C. bovis , confirmando o diagnóstico ambulatorial e a eficácia do método de PCR utilizado. Em virtude da positividade observada para C. bovis nos exames histopatológico e PCR, particularmente em fígado e esôfago, sugere-se que seja reformulado o artigo 176 do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal, incluindo estes locais na rotina de inspeção nos matadouros.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Dias F.E.F., Nunes C.M., Cavalcante T.V., Santos H.D. Minharro S. & Garcia J.F. 2012. [Fluorescent Multiplex PCR for detection of bacteria in semen bovine.] PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(3):211-216. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, BR 153 Km 132, Zona Rural, Araguaína, TO 77804-970, Brazil. E-mail: eldadias@uft.edu.br This study aimed to evaluate the threshold of detection of fluorescent multiplex PCR coupled with capillary electrophoresis for detection of infectious agents in semen samples from experimentally infected with decreasing concentrations of the bacteria Brucella abortus, Leptospira interrogans serovar pomona, Campylobacter fetus and Haemophilus somnus. Samples of bovine semen were experimentally infected with decreasing concentrations of bacteria obtained from serial dilutions in the base 10 so as to obtain samples containing a long time until 10-7 bacteria/mL from the initial concentration of Lepstospira pomona, Brucella abortus, Haemophilus somnus and Campylobacter fetus. The dilutions were made individually for each bacterium, as well as in different concentrations needed to standardize the multiplex PCR test. DNA extractions of all solutions containing sperm and bacteria analyzed in this study were performed according to protocol described by Heinemann et al. (2000). The multiplex PCR products were analyzed by electrophoresis on 8% polyacrylamide gel and capillary electrophoretic separation system for automated equipment in the analysis of DNA fragments MegaBACE. We observed amplification of fragments of 193pb, 330pb, 415pb and 400bp from the DNA of B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus respectively. The analysis by capillary electrophoresis of multiplex PCR products of DNA for simultaneous detection of the four pathogens was observed by detecting the dilution of 10-3 bacteria / mL times the initial concentration of the stock solution of each bacterium. The multiplex PCR coupled with capillary electrophoresis was first used for the direct diagnosis of four pathogenic bacteria in semen, proving to be a rapid method to detect bacteria that cause reproductive disorders.

• Semen sêmen

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Dias F.E.F., Nunes C.M., Cavalcante T.V., Santos H.D. Minharro S. & Garcia J.F. 2012. [Fluorescent Multiplex PCR for detection of bacteria in semen bovine.] PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(3):211-216. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, BR 153 Km 132, Zona Rural, Araguaína, TO 77804-970, Brazil. E-mail: eldadias@uft.edu.br Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detecção da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detecção de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes de bactérias obtidas através de diluições seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentração inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As diluições foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentrações necessárias para a padronização do teste de multiplex PCR. As extrações de DNA de todas as soluções contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplificação de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detecção simultânea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL vezes da concentração inicial da solução estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detecção de bactérias causadoras de doenças reprodutivas.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Biscola N.P., Fornazari F., Saad E., Richini-Pereira V.B., Campagner M.V., Langoni H., Barraviera B. & Ferreira Junior R.S. 2011. Serological investigation and PCR in detection of pathogenic leptospires in snakes. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(9):806-811. Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, Universidade Estadual Paulista, Fazenda Experimental Lageado, Rua José Barbosa de Barros 1780, Botucatu, SP 18610-307, Brazil. E-mail: rseabra@cevap.org.br Detection of Leptospira by PCR had not yet been described in snakes. This study investigated, by microscopic agglutination test (MAT) and PCR, the presence of antibodies to Leptospira spp. and Leptospira spp., respectively, in venomous and non-venomous wildlife and captivity snakes. All snakes were divided into three groups to be compared: Group 1 (wildlife snakes - WS); Group 2 (snakes in intensive captivity - IC), and Group 3 (collective semi-extensive captivity -CC). Of the 147 snakes studied, 52 (35.4%) were positive for leptospirosis by MAT, 8 (15.4%) belonging to Group 1 (WS), 34 (65.4%) to Group 2 (IC) and 10 (19.2%) to Group 3 (CC). Jararaca (Bothrops jararaca) presented the highest average titer (66.7%, N=22/33) among the three group studied, and Hardjo prajtino was the most prevalent serovar (88.5%, N=46/52), with titers varying from 100 to 3200. Leptospira interrogans was revealed by PCR in kidney and liver of caiçaca (Bothrops moojeni) and jararaca-pintada (Bothrops pauloensis), showing 100% and 93% identity respectively. Future studies should be carried out for better understanding of the role of snakes as a reservoir of Leptospira in nature.

• Leptospira spp. Bothrops jararaca Bothrops moojeni Hardjo prajtino

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Biscola N.P., Fornazari F., Saad E., Richini-Pereira V.B., Campagner M.V., Langoni H., Barraviera B. & Ferreira Junior R.S. 2011. Serological investigation and PCR in detection of pathogenic leptospires in snakes. [Investigação sorológica e PCR na detecção de leptospiras patogênicas em serpentes.] Pesquisa Veterinária Brasileira 31(9):806-811. Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, Universidade Estadual Paulista, Fazenda Experimental Lageado, Rua José Barbosa de Barros 1780, Botucatu, SP 18610-307, Brazil. E-mail: rseabra@cevap.org.br A detecção de Leptospira pela técnica de PCR não havia sido descrita em serpentes. Este estudo investigou pelo teste de aglutinação microscópica (MAT) e PCR, a presença de anticorpos anti-Leptospira spp. e Leptospira spp., respectivamente, em serpentes peçonhentas e não peçonhentas de vida livre e de cativeiro. As serpentes foram divididas em três grupos para comparação: Grupo 1 (serpentes recém-chegadas da natureza - WS); Grupo 2 (serpentes em regime de cativeiro intensivo -IC) e Grupo 3 (serpentes em regime de cativeiro coletivo semi-extensivo - CC). Do total de 147 serpentes estudadas, 52 (35,4%) foram positivas para leptospirose pelo MAT, as quais 8 (15,4%) pertenciam ao Grupo 1 (WS), 34 (65,4%) ao Grupo 2 (IC) e 10 (19,2%) ao Grupo 3 (CC). Das espécies estudadas, a jararaca (Bothrops jararaca) apresentou maior soropositividade (66,7%, N=22/33). O sorovar mais prevalente foi o Hardjo prajtino (88,5%, N=46/52) e os títulos variaram de 100 a 3200. Leptospira interrogans foi revelada por PCR nos rins e no fígado de caiçaca (Bothrops moojeni) e de jararaca-pintada (Bothrops pauloensis), mostrando 100% e 93% de identidade, respectivamente. Futuros estudos devem ser realizados para melhor compreensão do papel das serpentes como reservatório de leptospiras na natureza.